अध्ययन में रूमेन तरल पदार्थ के दाताओं के रूप में इस्तेमाल किए गए जानवरों को शामिल करने वाली सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को फ्लोरिडा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत आयोजित किया गया था। इसके अलावा, सभी तरीके IACUC दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किए गए थे। निम्नलिखित अध्ययन ARRIVE दिशानिर्देशों के अनुसार रिपोर्ट किया गया है।

सांख्यिकीय विश्लेषण

कुल नमूना आकार n = 12 प्रति तनाव परीक्षण के लिए प्रत्येक उपचार का परीक्षण कम से कम तीन जैविक प्रतिकृति (n 3) के साथ किया गया था। महत्व घोषित किया गया था पी ≤ 0.05, जबकि प्रवृत्ति 0.05 <पी 0.10।

लॉजिस्टिक फ़ंक्शन का उपयोग विकास दर (μ) और अंतराल समय (अंतराल) की भविष्यवाणी करने के लिए किया गया था। के अनुसार41इस्तेमाल किया लॉजिस्टिक फ़ंक्शन था:

$$Y={y}_{0}+frac{C}{बाएं(1+{exp}^{बाएं[4*mu max*frac{lag-t}{C}+2right]}दाएं)}$$

Y वास्तविक ODt है, y0 प्रारंभिक OD . है0μmax अधिकतम विशिष्ट विकास दर है, और C OD से OD की वृद्धि है0 की है किटी.

एसएएस विश्लेषण के लिए इनपुट के रूप में अनुमानित अधिकतम विशिष्ट विकास दर और अंतराल समय का उपयोग किया गया था। अधिकतम विशिष्ट विकास दर, अंतराल समय, और अमोनिया, कार्बनिक अम्लों की सांद्रता पर उपचार के प्रभावों का विश्लेषण एसएएस की मिश्रित प्रक्रिया का उपयोग करके विचरण (एनोवा) के कम से कम वर्ग विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था।

इस्तेमाल किया गया सांख्यिकीय मॉडल था:

$${y}_{i}=mu +{T}_{i}+{E}_{j}+{varepsilon }_{ij}$$

जहाँ y एक आश्रित चर है, μ समग्र माध्य है, ({टी}_{i}) उपचार का निश्चित प्रभाव है,({ई}_{जे}) प्रायोगिक रन है, और ({varepsilon }_{ij}) यादृच्छिक त्रुटि है। प्रायोगिक रन को यादृच्छिक प्रभाव माना जाता था।

रूमाल द्रव का अंश

रूमेन-कैन्युलेटेड होल्स्टीन गाय को कुल मिश्रित राशन (डीएम आधार: 60% पूरे पौधे मकई सिलेज, 12.5% ​​ग्राउंड मकई, 13% साइट्रस लुगदी, 12% सोयाबीन भोजन, और 2.5% खनिज और विटामिन से प्राप्त किया गया था। मिश्रण)। सुबह के भोजन के लगभग 3 घंटे बाद, रूमाल सामग्री को मैन्युअल रूप से एकत्र किया गया (7 एल) और चीज़क्लोथ की चार परतों के माध्यम से पूर्व-गर्म थर्मस बोतलों में डाला गया और तुरंत प्रयोगशाला में ले जाया गया। सामग्री को दो-परत चीज़क्लोथ के माध्यम से फिर से तनावपूर्ण किया गया, बीकर में स्थानांतरित किया गया, और 15 मिनट के लिए बर्फ में डुबोया गया। तनावग्रस्त रूमाल द्रव (लगभग 14 L) को लगातार तीन बार सेंट्रीफ्यूज किया गया (Sorvall RC-5B रेफ्रिजरेटेड सुपरस्पीड सेंट्रीफ्यूज, ड्यूपॉन्ट इंस्ट्रूमेंट्स® विलमिंगटन, DE)। पहले 1000× . परजी 10 मिनट के लिए, फिर सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और 11,250 × पर फिर से सेंट्रीफ्यूज किया गयाजी 20 मिनट के लिए, फिर प्राप्त बैक्टीरिया की गोली, मिली-क्यू पानी में फिर से जुड़ गई और 16,250 × पर तीसरी बार सेंट्रीफ्यूज हुई।जी 20 मिनट के लिए बैक्टीरिया की गोली प्राप्त करने के लिए जिसे बाद में मिली-क्यू पानी में फिर से निलंबित कर दिया गया था। अंत में, बैक्टीरियल छर्रों को पाइरोजेन-मुक्त ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया गया, होमोजिनाइज़ किया गया और मिली-क्यू पानी का उपयोग करके 15 एमएल तक पतला किया गया और बाद में रूमाल एलपीएस निष्कर्षण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया गया।

रुमिनल लिपोपॉलेसेकेराइड निष्कर्षण

एक संशोधित हॉट-फिनोल निष्कर्षण का उपयोग रुमेन-कैन्युलेटेड गाय से प्राप्त रूमिनल बैक्टीरिया से एलपीएस निकालने के लिए किया गया था जैसा कि पहले वर्णित है42,43 लेकिन नीचे वर्णित मामूली संशोधनों और सत्यापन के साथ। संक्षेप में कुल एलपीएस को रूमाल द्रव से अलग करने के लिए, बैक्टीरियल गोली को 100-110 डिग्री सेल्सियस पर उबाला गया था और 30 मिनट के लिए गर्मी ब्लॉक का उपयोग किया गया था और इसके बाद 50 एमएल मिली-क्यू पानी मिलाया गया था। बैक्टीरिया के निलंबन को तब 50 एमएल 90% फिनोल के साथ इलाज किया गया था जिसे 30 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म किया गया था। तब तैयारी को −20 °C में 30 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए रखा गया था और 5000 × पर सेंट्रीफ्यूज किया गया थाजी 10 मिनट के लिए जलीय (शीर्ष) परत को तब एकत्र किया गया था क्योंकि यह चांदी के दाग (थर्मो साइंटिफिक ™ पियर्स ™ सिल्वर स्टेन किट) के साथ परीक्षण के बाद एलपीएस की सबसे बड़ी सांद्रता प्रदर्शित करती है। तब जलीय परत को एक पुनर्जीवित सेल्युलोज डायलिसिस झिल्ली (फिशरब्रांड ™) में ले जाया गया था, जब तक कि मिलि-क्यू के खिलाफ 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलिसिस के लिए फिनोल मिलि-क्यू में 260 एनएम पर पता लगाने योग्य नहीं था। डायलाइज्ड नमूनों का तब 5 मिमी MgCl . के साथ इलाज किया गया था2 इसके बाद 20 μg/mL Dnase I (M0303s, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर दूषित डीएनए को नीचा दिखाने के लिए। इसके बाद, 20 μg/mL Rnase H (T3018, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए जोड़ा गया, ताकि दूषित आरएनए को नीचा दिखाया जा सके और, पिछले 30 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज़ के (फिशर बायोरिएजेंट™ प्रोटीनेज़ के, कैटलॉग नंबर बीपी1700-) 100) प्रोटीन संदूषण को दूर करने के लिए जोड़ा गया था। तैयारी को तब lyophilized किया गया था और कच्चे LPS द्रव्यमान का निर्धारण किया गया था। लियोफिलाइजेशन के बाद, सूखे नमूनों को 15 एमएल मिली-क्यू पानी में बदल दिया गया और 1110 × पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।जीकिसी भी ठोस को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए। सतह पर तैरनेवाला 0.15 एमएल 50 मिमी एसिटिक एसिड, 95% इथेनॉल के साथ इलाज किया गया था और ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब (क्विक-सील® राउंड-टॉप पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब) में स्थानांतरित किया गया था और फिर 4 डिग्री सेल्सियस और 105,000 × पर 8 घंटे के लिए काता गया था। जी एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में (ऑप्टिमा एक्सई, बेकमैन कल्टर लाइफ साइंसेज, इंडियानापोलिस, इंडियाना)। सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था और एलपीएस जैल को 2 एमएल एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी में बदल दिया गया था और शुद्ध एलपीएस के सूखे वजन को निर्धारित करने के लिए lyophilized किया गया था। रूमाल-व्युत्पन्न एलपीएस की शुद्धता और सामान्यीकरण की पुष्टि करने के लिए, अंतिम उत्पादों को निर्माता के निर्देशों के अनुसार पियर्स ™ सिल्वर स्टेन किट (थर्मो साइंटिफिक ™) के साथ देखा गया था। सभी मामलों में, पियर्स ™ सिल्वर स्टेन किट ने शुद्ध बैक्टीरियल आइसोलेट्स से शुद्ध किए गए एलपीएस के समान शुद्धता का संकेत दिया।

एलपीएस स्टॉक की तैयारी

की सांद्रताई कोलाई-एलपीएस ( इशरीकिया कोलीO111:B4, L2630; सिग्मा-एल्ड्रिच कं, सेंट लुइस, एमओ), रुमिनल-एलपीएस और मिक्स-एलपीएस 200,000 ईयू (सिग्मा-एल्ड्रिच प्रोटोकॉल पर आधारित 1 एनजी/एमएल = 10 ईयू) थे।

सभी एलपीएस स्टॉक अवायवीय स्थिति के तहत तैयार किए गए थे, जिसमें 25 मिलीग्राम ई कोलाईCO . के साथ फ्लश करते समय -LPS को 62.5 एमएल बाँझ, अवायवीय, गैर-जलीय पानी में मिलाया गया20.4 मिलीग्राम/एमएल उत्पन्न करने के लिए ई कोलाई-एलपीएस। रुमिनल-एलपीएस स्टॉक (25 मिलीग्राम) को 2 एमएल बाँझ, नॉनपायरोजेनिक पानी में फिर से जोड़ा गया और 20 मिनट के लिए सोनिक किया गया। sonication के बाद, अवायवीय परिस्थितियों में रूमिनल एलपीएस स्टॉक तैयार किया गया था और अंतिम मात्रा 0.4 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक उत्पन्न करने के लिए बाँझ, अवायवीय, गैर-पायरोजेनिक पानी में 62.5 एमएल लाया गया था। मिक्स-एलपीएस स्टॉक के लिए, 13.5 एमएल (5.4 मिलीग्राम के बराबर) ई कोलाई-एलपीएस) से ई कोलाई -एलपीएस स्टॉक को मिक्स-एलपीएस के 0.4 मिलीग्राम/एमएल उत्पन्न करने के लिए 13.5 एमएल (र्यूमिनल-एलपीएस के 5.4 मिलीग्राम के बराबर) रुमिनल-एलपीएस स्टॉक के साथ मिलाया गया था। सभी एलपीएस शेयरों को तब 0.45-माइक्रोन के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था, इसके बाद 0.22-माइक्रोन पॉलीएथर्सल्फ़ोन (पीईएस) झिल्ली सिरिंज फ़िल्टर (सेलट्रीट, पेपरेल, एमए) को सीरम की बोतलों में फ़िल्टर किया गया था जो पहले सीओ 2 और ऑटोक्लेव्ड थे। 0.4 मिलीग्राम/एमएल . की 0.5 मिलीलीटर मात्रा ई कोलाई -, रूमिनल- और मिक्स-एलपीएस स्टॉक में एलपीएस के 200,000 ईयू शामिल थे। हमने यह मानते हुए 0.4 मिलीग्राम/एमएल सांद्रता को चुना कि रूमाल एलपीएस समान होगा ई कोलाई वजन से एलपीएस। यह धारणा वजन, मात्रा और एंडोटॉक्सिसिटी में सभी खुराक को समान बनाने के लिए बनाई गई थी। मिक्स स्टॉक सॉल्यूशन की एंडोटॉक्सिसिटी को मान्य करने के लिए, हमने लिमुलस अमेबोसाइट लाइसेट परख का प्रदर्शन किया, जिसने 200,000 ईयू के करीब एंडोटॉक्सिसिटी का प्रदर्शन किया।

मीडिया

बेसल माध्यम में 240 मिलीग्राम K . होता है2एचपीओ4240 मिलीग्राम KH2बाद में4480 मिलीग्राम (एनएच .)4)2इसलिए4480 मिलीग्राम NaCl, 100 मिलीग्राम MgSO4· 7H2हे, 64 मिलीग्राम CaCl22 एच2ओ, 600 मिलीग्राम सिस्टीन हाइड्रोक्लोराइड, 1 ग्राम ट्रिप्टिसेज पेप्टोन (उत्पाद 212750; बीडी), और 0.5 ग्राम खमीर निकालने (उत्पाद 212750; बीडी) प्रति लीटर44; पीएच 6.5; ऑटोक्लेव्ड (121 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) O . को हटाने के लिए2 और O . के तहत ठंडा किया गया2मुक्त सीओ2. सोडियम कार्बोनेट (4 g/L) को बफर के रूप में जोड़ा गया था। Resazurin को redox संकेतक के रूप में जोड़ा गया था। ग्रोथ सबस्ट्रेट्स को अवायवीय रूप से तैयार किया गया और बाँझ परिस्थितियों में बेसल माध्यम से पेश किया गया। ग्लूकोज (20 मिमी अंतिम एकाग्रता) को विकास सब्सट्रेट के रूप में जोड़ा गया था एस बोविसी जेबी1 और वह स्वयं। जुगाली करने वाले पशुओं HD4 और 50 mM लैक्टेट (अंतिम सांद्रता) को विकास सब्सट्रेट के रूप में जोड़ा गया था एम. एल्सडेनी टी81. सभी मीडिया और मीडिया एडिटिव्स (ग्लूकोज या लैक्टेट) शुद्ध सुसंस्कृत रूमाल बैक्टीरिया के पिछले सहकर्मी की समीक्षा के अध्ययन पर आधारित थे44 और रनों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एक ही समय में तैयार किए गए थे।

जीवों

लैक्टेट पैदा करने वाले बैक्टीरिया सेलेनोमोनास जुगाली करने वाले HD4 (हिरासत की श्रृंखला: हर्बर्ट जे। स्ट्रोबेल, माइकल डी। फ्लाईथ) और स्ट्रेप्टोकोकस बोविस JB1 (हिरासत की श्रृंखला: जेम्स बी रसेल, माइकल डी। फ्लाईथ), और बैक्टीरिया का उपयोग करने वाला लैक्टेट मेगास्फेरा एल्सडेनी T81 (हिरासत की श्रृंखला: पॉल जे। वीमर, माइकल डी। फ्लाईथ) को केंटकी विश्वविद्यालय परिसर में फोरेज-एनिमल प्रोडक्शन रिसर्च यूनिट, एआरएस, यूएसडीए में बनाए गए स्टॉक कल्चर संग्रह से प्राप्त किया गया था। सभी आइसोलेट्स को ग्राम-दाग और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से शुद्धता के लिए सत्यापित किया गया था45. प्रत्येक स्ट्रेन के अंतराल, लॉग और स्थिर चरणों को निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक विकास वक्र विश्लेषण किए गए (डेटा नहीं दिखाया गया)।

जीवाणु वृद्धि के उपचार और माप

उपभेदों को 10 एमएल ग्रोथ मीडिया (लैक्टेट-प्रोड्यूसर्स: बेसल मीडियम प्लस 20 एमएम ग्लूकोज; लैक्टेट-यूटिलाइजर्स: बेसल मीडियम प्लस 50 एमएम लैक्टेट) में टीका लगाया गया और रातोंरात 39 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। वृद्धि वक्र प्रयोगों के लिए इनोकुलम को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक रातोंरात संस्कृति का ऑप्टिकल घनत्व (OD, अवशोषक 600 एनएम) दर्ज किया गया था। एक सौ l एस बोविसी जेबी1, 100 µ l वह स्वयं। जुगाली करने वाले पशुओंHD4, या 500 µ l एम. एल्सडेनीT81 को 0.5 mL LPS उपचार या नियंत्रण के साथ बेसल माध्यम में जोड़ा गया। उपचार थे (i) CTRL, नियंत्रण समूह (LPS मुक्त अवायवीय पानी); (ii) रम, रूमिनल-एलपीएस (0.4 मिलीग्राम/एमएल रूमाल एलपीएस); (iii) ई. कोली, ई कोलाई-एलपीएस (0.4 मिलीग्राम/एमएल ई कोलाई -एलपीएस); और (iv) मिक्स, 1:1 ई कोलाई: रुमिनल-एलपीएस (0.4 मिलीग्राम/एमएल मिक्स-एलपीएस)। तीनों LPS (RUM, E. COLI, MIX) की सांद्रता को पिछले अध्ययनों के आधार पर चुना गया था जिसमें SARA (200,000 EU) के साथ गायों में LPS सांद्रता को मापा गया था।46. सभी प्रायोगिक ट्यूबों को मिश्रण करने के लिए उल्टा कर दिया गया, लौ को निष्फल कर दिया गया, और आधारभूत किण्वन अंत उत्पादों (एनएच) के लिए 2 एमएल हटा दिया गया।3-एन, और कार्बनिक अम्ल) और प्रारंभिक ऑप्टिकल घनत्व (OD .)0) सभी उपभेदों को O . के तहत अवायवीय रूप से उगाया गया था2मुक्त सीओ2 हंगेट ट्यूबों में और बिना हिलाए 39 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। ऑप्टिकल घनत्व (ODt) के मामले को छोड़कर प्रति घंटा दर्ज किया गयाएस बोविसीJB1, जिसके लिए हर 30 मिनट में माप एकत्र किए गए, जब तक कि बैक्टीरिया का विकास एक पठार तक नहीं पहुंच गया। एक बार जब जीवाणु वृद्धि मध्य-घातीय चरण में पहुंच गई, तो 2 एमएल संस्कृति माध्यम को एपपेंडॉर्फ ट्यूबों में एकत्र किया गया, जिसे सेंट्रीफ्यूजेशन (15,000 ×) द्वारा स्पष्ट किया गया।जी2 मिनट), और किण्वन अंत उत्पादों (एनएच .) के बाद के निर्धारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए3-एन, और कार्बनिक अम्ल)। किण्वन अंत उत्पादों के नमूने निरंतर किण्वन स्थितियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए मध्य-घातीय चरण में एकत्र किए गए थे जैसा कि रूमेन में होता है (अंजीर। 1, 2, 3)।

किण्वन अंत उत्पाद विश्लेषण

मीडिया के नमूनों को पिघलाया गया, सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट किया गया (15,000× .)जी2 मिनट), और अमोनिया सांद्रता को फेनोलिक एसिड / हाइपोक्लोराइट विधि द्वारा निर्धारित किया गया था47. एचपीएलसी (डायोनेक्स, सनीवेल, सीए, यूएसए) द्वारा वाष्पशील फैटी एसिड, लैक्टेट और घुलनशील चीनी सांद्रता निर्धारित की गई थी। स्तंभ (Aminex HP-87H, Bio-Rad, Hercules, CA) को 0.4 एमएल/मिनट प्रवाह दर और जलीय एच के साथ 50 डिग्री सेल्सियस पर संचालित किया गया था।2इसलिए4 (0.17 एन) मोबाइल चरण। एक अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर (शोडेक्स / शोवा डेन्को, कानागावा, जापान) और एक यूवी डिटेक्टर (डायोनेक्स, सनीवेल, सीए, यूएसए) का उपयोग एल्यूटिंग यौगिकों का पता लगाने के लिए किया गया था।

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